1、連接體系中T載體和PCR片段的含量

一般市場(chǎng)上各種T載體包裝濃度約為50ng/ul。常規(guī)3kb左右的T載體在連接體系中加入總量為50ng-100ng，載體和片段摩爾比一般為1 ：3。比如，一個(gè)100bp片段連接到3kb的T載體中，T載體加入量60ng，則100bp片段應(yīng)該為60ng。

2、PCR片段的質(zhì)量

連接體系中PCR片段的質(zhì)量對(duì)連接成敗起著關(guān)鍵作用。

（1）PCR片段的長(zhǎng)度不同對(duì)連接的要求也不同，過(guò)長(zhǎng)或是較短的PCR片段需要調(diào)整連接體系；

（2）PCR片段的純度和特異性要較高；

（3）回收后的PCR片段濃度要合適，特別是長(zhǎng)度較長(zhǎng)的片段，濃度不能過(guò)低，PCR產(chǎn)物做膠回收會(huì)降低片段濃度。

3、 平板沒(méi)有菌斑或是很少

收到T載體后，一般要-20℃保存。如果短期內(nèi)不能使用完，建議將載體分裝保存。在室溫或是4℃放置過(guò)久，T載體會(huì)出現(xiàn)末端T丟失，載體降解等情況。

平板沒(méi)有菌斑或是很少，除T載體損壞外，其它原因有：

（1）連接體系中的連接酶及Buffer；

（2）末端含A的PCR片段質(zhì)量，包括純度、濃度以及特異性；

（3）感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量。

4、 連接長(zhǎng)度較短的PCR片段時(shí)，會(huì)出現(xiàn)菌斑過(guò)多，或是過(guò)少的情況

在同樣總量的情況下，DNA片段長(zhǎng)度越短，其摩爾數(shù)就會(huì)越多，這也是許多小的PCR片段容易連接，長(zhǎng)出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩爾數(shù)過(guò)多，就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限的T載體，導(dǎo)致連接效率降低，反而會(huì)使菌斑降低。所以，對(duì)于連接該類片段時(shí)，其摩爾數(shù)不能過(guò)多。

5、連接長(zhǎng)度較長(zhǎng)的PCR片段時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)菌斑較少或不長(zhǎng)斑等情況

常規(guī)連接時(shí)，當(dāng)PCR片段長(zhǎng)度大于2kb時(shí)，一般菌斑就會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。PCR片段長(zhǎng)度越大，菌斑就會(huì)越少。

可以通過(guò)以下方法調(diào)試：

（1）延長(zhǎng)連接時(shí)間；

（2）提高載體和片段的質(zhì)量，比如，片段要為特異性單一條帶，片段不能有降解趨勢(shì)，載體和片段的純度和濃度要高；

（3）可以嘗試調(diào)整載體和片段摩爾比，比如調(diào)整為1 ：1等。