原核表達(dá)系統(tǒng)是常被用來(lái)研究基因功能的成熟系統(tǒng)，由于原核表達(dá)系統(tǒng)具有包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整等缺陷，人們也開始利用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)研究基因。

自上世紀(jì)70年代基因工程技術(shù)誕生以來(lái)，基因表達(dá)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。并隨著人類基因組計(jì)劃實(shí)施的進(jìn)行，在技術(shù)方法上得到了很大發(fā)展，時(shí)至今日已取得令人矚目的成就。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)，其中多數(shù)基因功能不明。利用表達(dá)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA段的載體（一般為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化細(xì)菌（通常選用的是大腸桿菌），通過(guò)IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對(duì)比較低廉。但與此同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點(diǎn)：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)表達(dá)時(shí)間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難;而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。

為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點(diǎn)是：

① 根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計(jì)，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無(wú)同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制;

② 能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及;

③ 能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量。

因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)目的蛋白越來(lái)越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

1、酵母表達(dá)系統(tǒng)

最早應(yīng)用于基因工程的酵母是釀酒酵母，后來(lái)人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3種。以Pichia Pastoris應(yīng)用最多。

甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達(dá)載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1（A0x1），在該基因的啟動(dòng)子（PAXOI）作用下，外源基因得以表達(dá)。PAXOI是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，在以葡萄糖或甘油為碳源時(shí)。甲醇酵母中AOx1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)PAXOI可被誘導(dǎo)激活，因而外源基因可在其控制下表達(dá),將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達(dá)水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達(dá)載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，其中含有E.coli復(fù)制起點(diǎn)和篩選標(biāo)志，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增.目前，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入酵母菌的方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。

利用PAXOI表達(dá)外源蛋白時(shí),一般需很長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險(xiǎn)性化工產(chǎn)品。使得實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動(dòng)子代替PAXOI，不需要甲醇誘導(dǎo)。培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需更換碳源，操作更為簡(jiǎn)便，可縮短外源蛋白到達(dá)峰值水平的時(shí)間。

酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。

2、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(AcNPV)作為表達(dá)載體。在AcNPV感染昆蟲細(xì)胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆粒可形成包涵體。核多角體基因啟動(dòng)子具有極強(qiáng)的啟動(dòng)蛋白表達(dá)能力，故常被用來(lái)構(gòu)建桿狀病毒傳遞質(zhì)粒。克隆入外源基因的傳遞質(zhì)粒與野生型 AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細(xì)胞中不能形成包涵體，利用這一特點(diǎn)可挑選 出含重組桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞但效率比較低，且載體構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，一般需要4～6周。此外，昆蟲細(xì)胞不能表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達(dá)引起昆蟲細(xì)胞的裂解，胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，與 目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會(huì)降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學(xué)工作者先后嘗試用絲蛾肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或桿狀病毒ie-1基因啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括3個(gè)調(diào)節(jié)外源蛋白表達(dá)序列：

（1）Bombyx mori的肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；

（2）Bombyx mori的核型多角體病毒（BmNPV）的立早基因ie-1（編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉(zhuǎn)錄激活因子，可在體外激活肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子）；

（3） BmNPV的同源重復(fù)序列3（HR3）可作為肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)子。三者協(xié)同作用，可使轉(zhuǎn)錄活性提高 1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達(dá)水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒（HyNPV）被應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，該病毒由AcNPV及 Bni'qP發(fā)展而來(lái)。

一般情況下桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個(gè)問(wèn)題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達(dá)可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因?yàn)榉置谛远嚯谋环g后必須到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工才能被分泌至胞外。如果到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)前，前體多肽就伸展開來(lái)，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對(duì)最終的表達(dá)水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結(jié)合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，從而提高蛋白的分泌水平。

最近，人們又構(gòu)建了桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，以前人們認(rèn)為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細(xì)胞（如 sf9、sf21）中復(fù)制，不能在其他昆蟲細(xì)胞（如果蠅細(xì)胞）中復(fù)制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細(xì)胞。在果蠅細(xì)胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動(dòng)子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體利用的是果蠅啟動(dòng)子如Hsp70啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等，其中，Hsp70啟動(dòng)子的作用最強(qiáng)。重組桿狀病毒感染S2細(xì)胞后不會(huì)引起宿主細(xì)胞的裂解，且蛋白表達(dá)水平與鱗翅目細(xì)胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用前景的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其操作安全，表達(dá)量高，目前與酵母表達(dá)系統(tǒng)一樣被廣泛應(yīng)用于基因工程的各個(gè)領(lǐng)域中。

3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

由哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等。

將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞主要通過(guò)2類方法 ：一是感染性病毒顆粒感染宿主細(xì)胞，二是通過(guò)脂質(zhì)體法、顯微注射法 、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊?xì)胞中。外源基因的體外表達(dá)一般采用質(zhì)粒表達(dá)載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細(xì)胞可建立高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，而利用COS細(xì)胞可建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當(dāng)大（約187kb），利用它作為載體可同時(shí)插入幾種外源基因，從 而構(gòu) 建多價(jià)疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系也可通過(guò)其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細(xì)胞染色體，具有潛在的危險(xiǎn)性。

由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會(huì)大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過(guò)CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入laxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)Cre介導(dǎo)兩個(gè)laxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們?cè)跅U狀病毒中插入巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)引起病毒基因的表達(dá)，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移為我們提供了很好的途徑。

利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動(dòng)子有關(guān)如熱休克蛋白啟動(dòng)子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達(dá)特異性差;當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時(shí)表達(dá)有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對(duì)細(xì)胞造成損傷等。

為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負(fù)調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子（fIA）的序列，在沒(méi)有四環(huán)素或強(qiáng)力毒素存在的情況下 tTA可引起下游目的基因表達(dá)。隨后Gossen等又對(duì)tTA的氨基酸序列進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒(méi)有四環(huán)素的情況下啟動(dòng)子不被激活，而在加入四環(huán)素或強(qiáng)力毒素后目的基因高效表達(dá)。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效可控制性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

外源蛋白的表達(dá)會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，一個(gè)主要問(wèn)題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達(dá)。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動(dòng)物中穩(wěn)定表達(dá)異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順?lè)醋觤RNA。內(nèi)部的順?lè)醋油ㄟ^(guò)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IREs）介導(dǎo)進(jìn)行翻譯，通過(guò)持續(xù)選擇壓力，無(wú)需繁瑣的篩選過(guò)程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達(dá)抗體分子的重組體。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細(xì)胞時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況而定。

利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用。通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動(dòng)物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項(xiàng)技術(shù)還不很成熟，有待進(jìn)一步研究。

4、結(jié)語(yǔ)

目前已經(jīng)建立了多種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，但它們都有其優(yōu)點(diǎn)和不足，這就需要我們根據(jù)自己的要求選用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)理想的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)需要符合下述幾個(gè)方面的要求：

① 特異性：該系統(tǒng)不受其他內(nèi)源因素的影響，僅能被外源的非毒性藥物所活化。

② 非干擾性：該系統(tǒng)成分不能對(duì)細(xì)胞通路有干擾。

③ 可誘導(dǎo)性：該系統(tǒng)在非活化狀態(tài)下本底活性最低，而在活化狀態(tài)下能快速產(chǎn)生高水平的基因表達(dá)。

④ 誘導(dǎo)劑的生物利用率：調(diào)節(jié)分子能快速滲透人各組織，能通過(guò)胎盤屏障及血腦屏障。

⑤ 可逆性：誘導(dǎo)劑能快速被各組織清除使該系統(tǒng)很快恢復(fù)非活化狀態(tài)。

⑥ 劑量依賴性：該系統(tǒng)的反應(yīng)與誘導(dǎo)劑的濃度成正比，以便進(jìn)行定性定量分析。

總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不完全相同;哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后的加工不完全相同，因而產(chǎn)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時(shí)會(huì)有差別。Van der GeId等利用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了蛋白激酶（PR30），并對(duì)它們的抗原性進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有與抗PR3抗體結(jié)合的所有表位，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的PR3具有大部分表位，而在 甲醇酵母中表達(dá)的PR3只具有少數(shù)幾個(gè)表位。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，必須充分考慮各種因素，如所需表達(dá)的蛋白質(zhì)性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)條件、生產(chǎn)成本、表達(dá)水平、安全性等，權(quán)衡利弊后再選擇相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)。

真核細(xì)胞常見(jiàn)表達(dá)載體

（1）pCMVp-NEO-BAN載體

特點(diǎn): 該真核細(xì)胞表達(dá)載體分子量為6600堿基對(duì)，主要由CMVp啟動(dòng)子、兔β-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成， 在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達(dá)外源目的基因。更重要的是，由于該真核細(xì)胞表達(dá)載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。

插入外源基因的克隆位點(diǎn)包括Sal1、BamH1和EcoR1位點(diǎn)。注意在此載體中有二個(gè)EcoR1位點(diǎn)存在。

（2）pEGFP, 增強(qiáng)型絳色熒光蛋白表達(dá)載體（Enhanced Fluorecent Protein Vector）

特點(diǎn):   pEGFP表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動(dòng)子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號(hào)組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。

用途：該表達(dá)載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點(diǎn)，將外源基因扦入這些位點(diǎn)，將合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可確定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和/或組織中的定位。

亦可用于檢測(cè)克隆的啟動(dòng)子活性（取代CMV啟動(dòng)子,Acet1-Nhe1）。

3、pEGFT-Actin, 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/人肌動(dòng)蛋白表達(dá)載體

特點(diǎn)：pEGFP-Actin表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿β-肌動(dòng)蛋白基因，在PCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動(dòng)子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號(hào)組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。

用途：pEGFP-Actin載體在真核細(xì)胞表達(dá)EGFP-Actin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動(dòng)蛋白，因而在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)含肌動(dòng)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

4、pSV2表達(dá)載體

特點(diǎn)：該表達(dá)質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)在真核細(xì)胞目的基因進(jìn)行表達(dá)的，克隆位點(diǎn)為Hind111。SV40啟動(dòng)子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來(lái)篩選、建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。

5、CMV4 表達(dá)載體

特點(diǎn)：該真核細(xì)胞表達(dá)載體由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，多克隆區(qū)域酶切位點(diǎn)選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長(zhǎng)基因片段以及SV40復(fù)制原點(diǎn)和fl單鏈復(fù)制原點(diǎn)。但值得注意的是，該表達(dá)載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。

其他常用克隆Vector：

pBluscript II KS DNA 15 ug

pUC18 DNA 25 ug

pUC19 DNA 25 ug

說(shuō)明：

pBluescript II kS、pUC18 & Puc19載體適合于DNA片段的克隆、DNA測(cè)序和對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源DNA片段扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細(xì)胞，并在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，含有外源DNA載體的細(xì)胞將為白色菌落，而無(wú)外源DNA片段載體的細(xì)胞則為蘭色菌落，由此易于篩選有無(wú)外源DNA片段的載體。此外，這些載體中有便于測(cè)序的M13、T7和T3的通用引物進(jìn)行DNA測(cè)序。

保存液：TE Buffer

TE Buffer組成：

10mM Tris.HCL(Ph 8.0)

1mM EDTA

用途：

克隆外源DNA片斷.

進(jìn)行基因表達(dá).

使用M13、T7和T3引物進(jìn)行測(cè)序.

存在的問(wèn)題

細(xì)胞的生命活動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，有些生命活動(dòng)的機(jī)理還不完全清晰，由于插人的目的基因不同，載體構(gòu)建栗用的順式組件不同，組裝的空間位置不同，采用的表達(dá)系統(tǒng)不同，目的基因表達(dá)水平和陽(yáng)性克隆篩選率都會(huì)有很大差異。另外，由于所有的順式元件存在種屬和組織特異性，所構(gòu)建的高效表達(dá)載體不一定在所有細(xì)胞株中均高效表達(dá)。再者，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的差異，轉(zhuǎn)染方法的不同培養(yǎng)時(shí)閹的長(zhǎng)短，篩選藥物濃度的高低，對(duì)表達(dá)量都有很大影響。所以，需要綜合評(píng)價(jià)一個(gè)表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)，排除一些不定因素，篩選出最佳組合

真核表達(dá)載體趨向于既有利于擴(kuò)增目的基因又有利于篩選陽(yáng)性克隆的載體的構(gòu)建。許多有效的應(yīng)用范圍廣的強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子被人發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于載體中，大大提高了目的基因的表達(dá)量，另外一些強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子，如 SV40早期啟動(dòng)子+PHTLv，已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞系中。

應(yīng)用以GS為篩選標(biāo)志的表達(dá)載體可兼有篩選和擴(kuò)增目的基因兩種功能，是目前研究的重點(diǎn)。以IRES連接的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體已成為核表達(dá)載體的主體。在同一啟動(dòng)子操縱下，篩選基因或報(bào)告基因與目的基因轉(zhuǎn)錄在同一mRNA上通過(guò) IRES的作用，表達(dá)出兩種蛋白，因而在理論上可認(rèn)為，通過(guò)了篩選或表達(dá)了報(bào)告基因的克隆必為陽(yáng)性克隆，即表達(dá)目的基因的克隆，有報(bào)道說(shuō)這種雙順?lè)醋拥墓脖磉_(dá)率為90%。這就大大提高了篩選率，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

將強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可擴(kuò)增的篩選標(biāo)志組裝在同一載體上，構(gòu)建高效表達(dá)和篩選的表達(dá)載體并將其運(yùn)用于最合適的表達(dá)系統(tǒng)中，是當(dāng)今真核表達(dá)載體構(gòu)建研究發(fā)展方向。

真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要包括酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。真核細(xì)胞常見(jiàn)表達(dá)載體為：pCMVp-NEO-BAN載體、pEGFP,增強(qiáng)型絳色熒光蛋白表達(dá)載體、pEGFT-Actin 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/人肌動(dòng)蛋白表達(dá)載體、pSV2表達(dá)載體、CMV4 表達(dá)載體。