1、HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多,什么原因? 如何優(yōu)化？

高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會(huì)帶有HIS，所以經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優(yōu)化的方法如下：

? 可能原因：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白

策略：請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?慎用EDTA)。 

? 可能原因：雜質(zhì)對(duì)鎳離子有更高的親和性

策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合）和高產(chǎn)率（組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合）之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優(yōu)的咪唑結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20 個(gè)或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白。

策略2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，pH的范圍都需要進(jìn)行篩選以下是（His）6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板上進(jìn)行緩沖液條件的篩選以便決定最適的結(jié)合和洗脫條件。對(duì)于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時(shí)，將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設(shè)計(jì)成96個(gè)不同的混合配方。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于該目標(biāo)蛋白25mMTris，10mMNaCl，10％甘油，pH8.5的緩沖液適最佳的結(jié)合條件。

策略3：若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白，需要考慮多步純化的思路，離子交換（HiTrap Q HP or HiTrap SPHP） 和凝膠過濾（Superdex?Peptide，Superdex 75 or Superdex200）是必須的.以下是用?KTAxpress儀器進(jìn)行四步純化的實(shí)例。AC（親和），DS（脫鹽），IEX（離子交換），GF（凝膠過濾）所有的步驟都在?KTAxpress上自動(dòng)執(zhí)行,包括柱上的標(biāo)簽酶切。

? 可能原因：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起

策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（ 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的濃度(50%)減少非特異性的相互反應(yīng)；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

? 可能原因：洗滌不充分

策略：增加洗滌的次數(shù),使洗滌充分。

2、對(duì)于血清、腹水或細(xì)胞懸浮物來源的抗體樣品，有哪些樣品處理的方法？

在純化前，合適的樣品處理不僅可以幫助我們得到高純度高質(zhì)量的抗體,還有助于保護(hù)親和層析柱，延長(zhǎng)使用壽命。對(duì)于血清、腹水或細(xì)胞懸浮物來源的樣品經(jīng)常含有脂蛋白，酚紅，小分子污染物等等。 腹水中經(jīng)常含有高濃度的脂蛋白，這些脂蛋白和脂類物質(zhì)會(huì)堵塞層析柱，最好能在純化之前去除。方法一是在二價(jià)離子存在的情況下，硫酸右旋葡糖酐能夠沉淀脂蛋白，沉淀可以通過離心除去；方法二PVP能產(chǎn)生一個(gè)pH值依賴的沉淀效應(yīng)，PVP在pH＝7.0時(shí)能夠沉淀b-脂蛋白和球蛋白。很多時(shí)候，可以考慮進(jìn)樣前用親和結(jié)合緩沖液稀釋腹水，不僅保證樣品的結(jié)合pH，還有利于降低黏度。 酚紅是一種在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中的pH指示劑，雖然并不直接的影響純化，但是酚紅可能結(jié)合到某些純化介質(zhì)上，應(yīng)該盡可能早的被除去，可以使用脫鹽柱除去酚紅。 對(duì)于一些低分子污染物可以使用分級(jí)沉淀法去除，如硫酸銨沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脫鹽柱來更換緩沖液并除鹽，，把樣品換到合適的緩沖液中（PH和鹽濃度），并除去沒有用處的小分子。

3、為什么洗脫之后沒有看到正確的條帶？

首先我們先看樣品是否結(jié)合了？先查不同的種屬亞型參考“相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度”表（圖1），看有沒有親和性，柱子選得對(duì)不對(duì)。然后檢查結(jié)合緩沖液和樣品的pH是否7.3附近。必要時(shí)將原始樣品和流穿跑還原和非還原SDS-PAGE進(jìn)行分析，有條件可以做Western Blot，或檢測(cè)Elisa是結(jié)合上去沒有洗脫？

檢查洗脫緩沖液pH對(duì)否？

建議依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脫，跑電泳或ELisa等檢測(cè)洗脫產(chǎn)物

洗脫峰是否立即中和？

蛋白長(zhǎng)期在酸性條件下易水解，中和后也容易產(chǎn)生沉淀

跑電泳的loading buffer是否新鮮配置？（常遇到還原loading buffer中DTT失效，導(dǎo)致電泳條帶位置不對(duì)）