細(xì)胞污染嚴(yán)重性

污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問題。由每一種細(xì)胞有其獨(dú)特的培養(yǎng)體系，因此污染造成后果也不盡相同。某些污染的發(fā)生（特別是支原體和少部分的真菌）往往難以察覺檢測(cè)，而且污染源能長(zhǎng)期共存于培養(yǎng)體系中，在實(shí)驗(yàn)前期容易被忽視。培養(yǎng)的細(xì)胞作為個(gè)生物體，會(huì)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作相應(yīng)的反應(yīng)，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成潛在的威脅，而且隨著污染時(shí)間的長(zhǎng)而增加。培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能入培養(yǎng)環(huán)境造成污染。由于入侵的微生物在培養(yǎng)系中不斷增殖、代謝，因此生物性的污染對(duì)細(xì)胞的害最大。隨著污染微生物的不斷增殖，交叉污染可能性也不斷增加。此外，微生物代謝消耗大量需的養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此，認(rèn)識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性，建立細(xì)胞培規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可以有效地防止污染保證實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。

細(xì)胞污染的類型

一、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽Ｗ畛Ｒ姷挠懈锾m氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變而呈現(xiàn)黃色。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。

二、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間（發(fā)生卵圓形物體污染的幾率很大）。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

三、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。

培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。

四、病毒污染

采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

五、非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。

非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

污染來源及鑒別

一、污染來源

細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：

1、不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本

很多動(dòng)物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。

2、空氣

空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

3、清洗消毒

培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不徹底也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。

4、操作

來自操作者的污染主要有以下幾方面：

器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理。

操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。

培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。

操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。

細(xì)胞傾液時(shí)倒出培養(yǎng)瓶或者滴落在超凈臺(tái)上，未及時(shí)擦凈或者灼燒。

灼燒的火不夠旺。

移液管吸取液體時(shí)將空氣中的氣流吸入培養(yǎng)瓶中。

長(zhǎng)時(shí)間的將離心管放在離心機(jī)中，可能由于口沒有完全封閉而造成污染。

同一根吸管或者放置吸管的離心管長(zhǎng)時(shí)間使用造成的一管污染多瓶細(xì)胞交叉污染。

操作者操作時(shí)大聲說話，來回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等。

5、血清

市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。

二、污染的鑒別

1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)

（1）肉眼觀察  細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

（2）鏡下觀察  在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

（3）接種觀察  采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。

 2、支原體污染的檢測(cè)

（1）相差顯微鏡觀察  將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的支持物(一般用長(zhǎng)形蓋玻片)，24小時(shí)后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。

（2）熒光染色法觀察  用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長(zhǎng)滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258（生理鹽水配制）中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色試劑，染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。

（3）電鏡檢測(cè) 可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法。

（4）培養(yǎng)檢測(cè)  將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。

* 培養(yǎng)加熒光核染色是檢測(cè)支原體污染的黃金搭檔。

污染的預(yù)防

預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。在超凈臺(tái)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，特別注意在進(jìn)行移液，傾倒液體的操作過程會(huì)產(chǎn)生飛沫并沉積在超凈工作臺(tái)內(nèi)物體的表面。超凈工作臺(tái)的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會(huì)隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺(tái)不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會(huì)破壞超凈工作臺(tái)氣流的方向?qū)е嘛w沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動(dòng)、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺(tái)內(nèi)物品污染的主要因素造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應(yīng)盡可能減少超凈工作臺(tái)內(nèi)的物品。不同細(xì)胞系以及同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用，如胰酶、培養(yǎng)液等。否則，一個(gè)操作者的失誤可能引起所有細(xì)胞發(fā)生污染。

一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

一、無菌操作基本技術(shù)

1、 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)（laminar flow）以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以5% 新潔爾滅擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3、小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

 4、工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5、定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：

5.1、 CO2 鋼瓶之CO2 壓力

5.2、CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。 5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。

6、水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

要特別注意的幾點(diǎn)：

1、從物品、用品消毒滅菌著手

細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用，并且需要盡快使用，特別注意容易染菌的液體如培養(yǎng)基，瓊脂糖，血清等需要在低溫保存，減少染菌的幾率。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。。

2、從操作者做起

（1）操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。在制定好實(shí)驗(yàn)步驟后，頭腦清醒的進(jìn)無菌室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 備好一切所需要的試劑和培養(yǎng)瓶，防止在操作過程中來回跑動(dòng)尋找，增加染菌的幾率。在實(shí)驗(yàn)前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動(dòng)。工作開始要先用5%新潔爾滅擦手、擦帶進(jìn)的培養(yǎng)基瓶壁，和無菌操作臺(tái)。嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)則。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。盡量減少在超凈臺(tái)中物品的放置，特別注意不能將物品放置在流通空氣的慮孔上，以免降低整個(gè)超凈臺(tái)的工作效率。

（2）操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼，注意火苗要旺盛，如果酒精燈中的酒精用盡要及時(shí)補(bǔ)充。要盡量使用侵斜試劑瓶45°的管架，減少垂直放置培養(yǎng)瓶造成染菌的機(jī)會(huì)。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

（3）操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。

（4）操作過程中頭腦清醒，動(dòng)作敏捷果斷，打開的培養(yǎng)瓶和瓶口應(yīng)遠(yuǎn)離操作者手勢(shì)范圍，避免影響垂直的空氣流將操作者身上的病菌帶到培養(yǎng)細(xì)胞中。廢液鋼盡量避免使用敞口的容器，傾倒時(shí)要抬高一點(diǎn)，防止在傾倒廢液時(shí)濺起的液體污染瓶口。

（5）防止細(xì)胞交叉污染

在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。