1、如何選用特殊細胞系培養基？ 

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養最好首選AIM V（12005）培養基（SFM）。 

2、 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？ 

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 

3、GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 

4、什么培養基中可以省去加酚紅？ 

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 

5、如何用臺盼蘭計數活細胞？ 

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。 

6、 如何消除組織培養的污染？ 

當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 

（1）在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。 

（2） 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mgml。 

（3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。 

（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。 

（5）在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 

（6） 重復步驟4。 

（7） 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。 

7、 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

目錄上說，Hank's 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？ 

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2gL)中比在Hanks (0.35gL) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。 

8、 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。 

我試用SF900 II時，細胞生長良好，但是我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。 

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。 

9、 20°C下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？ 

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。 

下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況： 

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)＝6.78 

10、 室溫下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？ 

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。 

11、昆蟲細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少？ 

生長培養基的PH值對細胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0～6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的最適滲透壓是345-380mOsmkg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。 

12、High Five細胞有任何其它名稱嗎？ 

High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 

PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別 

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產培養基，也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。 

13、在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？ 

High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 gL Tween-80，1.0 gL Pluronic Poly-all。 

14、High Five細胞用多大的密度凍存？ 

3.0x10E6 cellsml。 

15、在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？ 

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。 

16、 如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？ 

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性最小，生活力最高。正如手冊上所顯示，通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。 

胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：

（1）去除培養基。 

（2）用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。 

（3）加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。 

（4）37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。 

（5） 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。） 

（6）離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。 

（7）用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 

17、 在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？ 

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位毫升細胞懸液。 

在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？ 

通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候計數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。 

Tech tips 

貯存在冰箱中的瓶口已開的培養基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。 

如果細胞培養基偶然被凍，您應該熔化培養基并觀察是否有沉淀產生。如果沒有沉淀產生，培養基可以正常使用，如果出現沉淀，只能丟棄這些培養基。 

當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 

一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 

總之，大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 

在進行傳代培養時，我們強烈推薦進行臺盼蘭活性記數。研究者常常通過一個簡單的稀釋（1∶4或1∶2）進行傳代，不進行活性檢測，您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞，這常?？赡軐е律L緩慢或培養物根本不生長。 

在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。