1、連接體系中T載體和PCR片段的含量

一般市場上各種T載體包裝濃度約為50ng/ul。常規3kb左右的T載體在連接體系中加入總量為50ng-100ng，載體和片段摩爾比一般為1 ：3。比如，一個100bp片段連接到3kb的T載體中，T載體加入量60ng，則100bp片段應該為60ng。

2、PCR片段的質量

連接體系中PCR片段的質量對連接成敗起著關鍵作用。

（1）PCR片段的長度不同對連接的要求也不同，過長或是較短的PCR片段需要調整連接體系；

（2）PCR片段的純度和特異性要較高；

（3）回收后的PCR片段濃度要合適，特別是長度較長的片段，濃度不能過低，PCR產物做膠回收會降低片段濃度。

3、 平板沒有菌斑或是很少

收到T載體后，一般要-20℃保存。如果短期內不能使用完，建議將載體分裝保存。在室溫或是4℃放置過久，T載體會出現末端T丟失，載體降解等情況。

平板沒有菌斑或是很少，除T載體損壞外，其它原因有：

（1）連接體系中的連接酶及Buffer；

（2）末端含A的PCR片段質量，包括純度、濃度以及特異性；

（3）感受態細胞的質量。

4、 連接長度較短的PCR片段時，會出現菌斑過多，或是過少的情況

在同樣總量的情況下，DNA片段長度越短，其摩爾數就會越多，這也是許多小的PCR片段容易連接，長出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩爾數過多，就會競爭結合有限的T載體，導致連接效率降低，反而會使菌斑降低。所以，對于連接該類片段時，其摩爾數不能過多。

5、連接長度較長的PCR片段時，常會出現菌斑較少或不長斑等情況

常規連接時，當PCR片段長度大于2kb時，一般菌斑就會出現下降趨勢。PCR片段長度越大，菌斑就會越少。

可以通過以下方法調試：

（1）延長連接時間；

（2）提高載體和片段的質量，比如，片段要為特異性單一條帶，片段不能有降解趨勢，載體和片段的純度和濃度要高；

（3）可以嘗試調整載體和片段摩爾比，比如調整為1 ：1等。