1、HIS標簽蛋白洗脫后雜帶較多,什么原因? 如何優化？

高純度的蛋白是純化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也會帶有HIS，所以經常會出現HIS標簽蛋白洗脫后有一些雜帶，可能的原因和優化的方法如下：

? 可能原因：蛋白酶部分降解了標簽蛋白

策略：請添加蛋白酶抑制劑，(慎用EDTA)。 

? 可能原因：雜質對鎳離子有更高的親和性

策略1：咪唑濃度必須優化，以確保高純度（宿主細胞蛋白質的低結合）和高產率（組氨酸標記的目標蛋白質的強結合）之間的最佳平衡。分步或者線性洗脫摸索出最優的咪唑結合和清洗濃度；在樣品中加入與結合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20 個或更多的柱床體積），可能分離出有相似結合強度的蛋白。

策略2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，pH的范圍都需要進行篩選以下是（His）6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板上進行緩沖液條件的篩選以便決定最適的結合和洗脫條件。對于單一目標蛋白在進行緩沖液篩選時，將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設計成96個不同的混合配方。實驗結果顯示對于該目標蛋白25mMTris，10mMNaCl，10％甘油，pH8.5的緩沖液適最佳的結合條件。

策略3：若以上優化的條件都不能去除雜質蛋白，需要考慮多步純化的思路，離子交換（HiTrap Q HP or HiTrap SPHP） 和凝膠過濾（Superdex?Peptide，Superdex 75 or Superdex200）是必須的.以下是用?KTAxpress儀器進行四步純化的實例。AC（親和），DS（脫鹽），IEX（離子交換），GF（凝膠過濾）所有的步驟都在?KTAxpress上自動執行,包括柱上的標簽酶切。

? 可能原因：雜質和標簽蛋白結合在一起

策略：在超聲破碎細胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（ 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的濃度(50%)減少非特異性的相互反應；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。

? 可能原因：洗滌不充分

策略：增加洗滌的次數,使洗滌充分。

2、對于血清、腹水或細胞懸浮物來源的抗體樣品，有哪些樣品處理的方法？

在純化前，合適的樣品處理不僅可以幫助我們得到高純度高質量的抗體,還有助于保護親和層析柱，延長使用壽命。對于血清、腹水或細胞懸浮物來源的樣品經常含有脂蛋白，酚紅，小分子污染物等等。 腹水中經常含有高濃度的脂蛋白，這些脂蛋白和脂類物質會堵塞層析柱，最好能在純化之前去除。方法一是在二價離子存在的情況下，硫酸右旋葡糖酐能夠沉淀脂蛋白，沉淀可以通過離心除去；方法二PVP能產生一個pH值依賴的沉淀效應，PVP在pH＝7.0時能夠沉淀b-脂蛋白和球蛋白。很多時候，可以考慮進樣前用親和結合緩沖液稀釋腹水，不僅保證樣品的結合pH，還有利于降低黏度。 酚紅是一種在實驗室細胞培養中的pH指示劑，雖然并不直接的影響純化，但是酚紅可能結合到某些純化介質上，應該盡可能早的被除去，可以使用脫鹽柱除去酚紅。 對于一些低分子污染物可以使用分級沉淀法去除，如硫酸銨沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脫鹽柱來更換緩沖液并除鹽，，把樣品換到合適的緩沖液中（PH和鹽濃度），并除去沒有用處的小分子。

3、為什么洗脫之后沒有看到正確的條帶？

首先我們先看樣品是否結合了？先查不同的種屬亞型參考“相對結合強度”表（圖1），看有沒有親和性，柱子選得對不對。然后檢查結合緩沖液和樣品的pH是否7.3附近。必要時將原始樣品和流穿跑還原和非還原SDS-PAGE進行分析，有條件可以做Western Blot，或檢測Elisa是結合上去沒有洗脫？

檢查洗脫緩沖液pH對否？

建議依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脫，跑電泳或ELisa等檢測洗脫產物

洗脫峰是否立即中和？

蛋白長期在酸性條件下易水解，中和后也容易產生沉淀

跑電泳的loading buffer是否新鮮配置？（常遇到還原loading buffer中DTT失效，導致電泳條帶位置不對）